簡介 

組織工程已成為治療受損或患病的器官和組織（例如血管和尿囊）的關鍵治療工具。1盡管如此，仍然還存在許多主要的挑戰需要克服，特別是在構建具有高細胞密度的組織和移植后炎癥預防方面。一種有前景的組織工程方法依賴于使用聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAM）接枝的細胞培養表面。2 其基本思想是通過簡單的溫度調控來實現PNIPAM改性基底上的細胞粘附/分離（圖1）。

圖 1.（a）細胞在聚N-異丙基丙烯酰胺接枝表面上的粘附（37℃）和脫離（20℃）示意圖。通過降低溫度可簡單地實現細胞收集。（b）在37℃和20℃下PNIPAM包被的培養皿上內皮細胞的顯微照片。注意：左側顯微照片中的細長形狀細胞表示在支持物上的細胞培養，而右側照片中的圓形細胞表示在溶液中的游離細胞。 

 

達到融合后，通過簡單地將細胞培養溫度從37℃降低至20℃，培養的細胞便可以以組織樣細胞單層或“細胞膜片”的形式從“智能”PNIPAM表面進行收集。這種細胞操作技術能夠在不使用可生物降解的聚合物支架的情況下將細胞膜片移植到宿主組織中，從而克服了傳統組織工程的主要限制。本文介紹了這一過程的化學基礎，首先我們對PNIPAM在水溶液中的性質進行了簡要的回顧。我們著重對用于獲得多功能細胞膜片的改性表面的設計和制造過程進行了介紹。

 

聚N-異丙基丙烯酰胺：無處不在的“智能”聚合物

PNIPAM可溶于有機溶劑，如氯仿、丙酮、甲醇和各種其他醇類。只要溶液保持在一定的冷卻環境，其便可溶于水。將PNIPAM水溶液加熱至32℃（濁點（CP）或較低臨界溶解溫度（LCST）），可立即將澄清溶液轉化為乳狀懸浮液。這種現象是可逆的：一旦乳狀懸浮液冷卻到32℃以下，它就會恢復澄清。3在20世紀60年代后期，Heskins和Guillet發表了水/ PNIPAM系統的第一個相圖，該相圖是通過測定相變溫度作為PNIPAM濃度的函數來構建的。4大約在同一時間，人們發現交聯的PNIPAM網絡（凝膠）在水中也表現出奇特的性質：它們在冷水中高度溶脹，但一旦加熱到32℃以上就會收縮。與PNIPAM溶液的情況一樣，凝膠的行為是可逆的，一旦冷卻到32℃以下就會膨脹回原來的體積。通過凝膠進行數百次膨脹/收縮循環，沒有發現材料疲勞的跡象。Allan S. Hoffmann注意到這種不同尋常的現象，他是第一批使用PNIPAM衍生物的溫度誘導相變性質的人，他將這些衍生物作為控制與生物醫學應用相關現象的觸發器，例如染料或藥物的釋放。5這項開創性工作奠定了響應系統領域的基礎，該系統持續吸引著科學家的想象力。6 由于許多其他水溶性聚合物也具有濁點，所以PNIPAM水溶液顯示出的熱誘導相變并不是唯一的。然而，由于其相變的清晰度、接近體溫的相變溫度、聚合物本身的穩健性、以及關于聚合物本身和相變信息的可用性，使得PNIPAM仍然是生物醫學應用的首選。

 

在分子水平上，宏觀相變對應于PNIPAM鏈的脫水和隨后的裸露疏水鏈塌陷成致密小球，進而聚集成較大中間小球（圖2）。7，8然而，相變不僅僅取決于溫度誘導的分子重排。雖然效果并不總是可預測，但其他幾個因素也可能影響PNIPAM的CP。

  圖 2.聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAM）水溶液的溫度響應特性; （a）當加熱到LCST以上時，水合延長的PNIPAM鏈塌陷成疏水小球，同時釋放結合的水分子; （b）PNIPAM重復單元的化學結構; （c）PNIPAM水溶液中溶液透射率隨溫度變化的曲線圖。LCST為相變曲線的中點。

 

分子量

聚合物分子量對濁點的影響程度已經得到了廣泛的討論。有一些報道表明PNIPAM在水中的濁點與分子量直接相關，而另一些則報道了CP對分子量的逆相關性，還有一些則報道了PNIPAM水溶液的CP與分子量無關。當比較相對短的聚合物鏈（M w <20,000 g/L）的結果時，其差異特別顯著，其原因是鏈端的化學性質對CP值有顯著影響。9具有親水端基的聚合物傾向于在低濃度溶液中表現出相對高的濁點，而具有疏水端基的聚合物在相同條件下通常具有較低的CP。10 這些趨勢對于具有強疏水性端基的PNIPAM溶液確又不適用，例如正十八烷基鏈，其在水中能自組裝形成花和星形膠束。11，12 

 

溶劑系統

多溶劑系統的存在也會對PNIPAM的CP產生影響。例如，在室溫下，PNIPAM在一系列組成情況下都不溶于水/甲醇混合溶液 - 表現出稱為共同非溶劑的現象。13 

 

鹽的存在

鹽的存在也會影響PNIPAM水溶液的CP，一些鹽會導致CP增加，而添加其他鹽又可能會導致CP降低。目前已經有幾種解釋可以來說明這些觀察結果。14一旦完全理解了影響PNIPAM相變的因素，就可以使用它們來定制和優化PNIPAM以用于進一步的應用。然而，人們已經發現了這種智能聚合物的令人興奮的用途。

 

用于細胞膜片工程的溫度響應細胞培養皿

PNIPAM包被的細胞培養皿是通過電子束照射（0.3MGy，150kV）NIPAM單體進行制備，將溶于2-丙醇中的NIPAM溶液固定在市售的組織培養聚苯乙烯（TCPS）細胞培養皿上（圖3）。該處理使得NIPAM的聚合和在TCPS表面上進行聚合物鏈的共價接枝過程同時進行。該方法干凈、易于按比例放大和圖案化，并且可以精確控制聚合物層的厚度。對于大多數細胞培養應用來說，接枝PNIPAM層的厚度應在15-20nm范圍內，這相當于接枝密度為1.4–2.0 μg/cm 2。15 

圖 3.聚N-異丙基丙烯酰胺接枝細胞培養皿的制備步驟示意圖。

 

在與普通TCPS培養皿類似的培養條件下，不同種的細胞類型可以在溫度響應性PNIPAM培養表面上粘附和生長。在37℃達到細胞匯合后，將培養皿冷卻至32℃以下（通常至20℃）。聚合物鏈再次水合并排斥細胞，從而誘導細胞以由連續的單層細胞組成的細胞片的形式從培養表面上剝離。在常規的基于細胞的組織工程中，通常將蛋白水解酶（例如，胰蛋白酶和分散酶）添加至培養基中，從而通過破壞細胞粘附分子和細胞外基質（ECM）蛋白來分離細胞。這一處理還可能影響到對各種不同細胞類型來說具有獨特重要功能的細胞膜蛋白。在溫度響應性表面上培養的細胞則不需要酶處理來收集。因此，仍然具有其基礎ECM蛋白的回收細胞膜片可以轉移到新培養皿、其他細胞膜片上或活組織中。目前幾個細胞膜片組織工程臨床試驗正在使用單細胞膜片進行移植，例如角膜和牙周韌帶。正在進行的研究包括多個細胞膜片的同型和異型分層，以創建3D組織樣結構，如心臟或肝臟組織。16

用于異型細胞共培養的圖案化溫度響應表面

為了模擬特定的組織功能，有必要再生出具有異型細胞-細胞相互作用的空間有序組織結構。由于不同細胞類型的粘附和增殖特性通常不盡相同，因此在單個3D組織結構中整合多種細胞類型并非易事。在大多數情況下，不同細胞類型的共培養在微圖案化表面上進行。由于PNIPAM的LCST也可以通過摻入共聚單體來調節，因此可以根據這一點容易制造出溫度響應的微圖案化表面。具有親水共聚單體的NIPAM共聚物LCST> 32℃的，而摻入疏水性單體，例如甲基丙烯酸正丁酯（BMA），的NIPAM共聚物，其LCST <32℃。為了制備微圖案化表面，可將溶于2-丙醇中的BMA分散在PNIPAM接枝的TCPS培養皿上。隨后，通過不銹鋼微圖案掩模用電子束照射BMA涂覆的表面。17 BMA單體則會被接枝到照射區域中的預成型PNIPAM層上，而在掩蔽部分則保留了原始PNIPAM。照射區域的相變溫度則會低于32℃。因而可以通過控制BMA的摻入水平來調節實際的LCST值。 圖4描述了將該圖案化方法應用于肝細胞（HC）和內皮細胞（EC）的共培養中。

  圖 4.圖案化細胞共培養和使用圖案化溫度響應表面收集共培養細胞膜片的示意圖。（a）將肝細胞（HC）接種并在27℃下培養，結果導致HC定位于表現出疏水性的P（NIPAM-co-BMA）接枝島上。（b）接種內皮細胞（EC）并在37℃下培養，從而獲得圖案化的共培養物。（c）將溫度降低至20℃誘導共培養細胞膜片的分離。收集的圖案化共培養細胞膜片（右;比例尺：1厘米）。

 

首先，將HCs接種在保持在27℃的微圖案界面上。它們完全粘附在P（NIPAM-co-BMA）結構區域上，該區域在該溫度下是脫水（疏水）的。PNIPAM結構區域在27℃是水合（親水）的，因而排斥細胞（圖4a）。接下來，將HC涂覆的界面加熱至37℃。PNIPAM結構區域因而變得疏水并且用于EC的接種。EC粘附至PNIPAM區域并進行增殖，（圖4b和4C）。然后，將培養溫度降至20℃，從而觸發整個表面的水合作用。共培養的細胞單層自發分離，從而產生具有異型細胞相互作用的連續細胞膜片?；厥盏墓才囵B細胞膜片可以被操作并夾在其他細胞片之間，用于制備組織模擬多層材料。

 

溫度響應培養皿的功能化

化學反應性（功能性）共聚單體可以摻入接枝的PNIPAM層中，并作為引入生物活性分子的位點，如圖5所示。15

圖 5.整聯蛋白受體和RGDS（Arg-Gly-Asp-Ser）肽之間的溫度響應親和力控制示意圖。通過形成酰胺鍵，RGDS配體與P(NIPAM-co-CIPAAm)偶聯，其中使用 N-(3-二甲基氨基丙基)- N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（水溶性碳二亞胺（WSC，產品編號E1769）作為偶聯劑。在37℃時，溫度響應性聚合物收縮以使RGDS配體（紅色珠子）暴露于細胞膜整聯蛋白受體（黃色）。因此，可以在固定有RGDS的溫度響應培養皿上，在無血清條件下進行細胞培養。并且，通過將培養溫度降低至20℃，可以實現非侵入性地將細胞進行收集。RGDS配體會保持附著于溫度響應性聚合物表面。

 

首先，通過電子束將NIPAM和2-羧基異丙基丙烯酰胺（CIPAAm）的混合物聚合成NIPAM / CIPAAm混共聚物，并接枝至TCPS培養皿上（CIPAAm含量：1-5mol％）。隨后，使用標準的酰胺鍵形成方法，將合成的細胞粘附四肽，Arg-Gly-Asp-Ser（RGDS，產品編號A9041共價連接至接枝有PCH（NIPAM-co-CIPAAm）的TCPS培養皿上。18在補充有重組生長因子的無血清培養條件下，該界面上存在的RGDS在37℃下可促進細胞粘附和細胞生長至融合。在達到融合后，只需簡單地將溫度降低至20℃，便可以像PNIPAM接枝培養皿的情況一樣，將細胞以完整的細胞膜片形式進行收集。PNIPAM表面鏈的再水合會不可逆地破壞表面固定的RGDS肽與細胞膜整聯蛋白受體之間的相互作用。該策略顯著縮短了培養時間，并使研究人員可以在沒有傳統胎牛血清的情況下進行細胞生長，這是一個重要的考慮因素，因為在應用于臨床人體細胞療法的組織制造中使用哺乳動物來源的產品可能存在相關的風險。

 

結論

溫度響應細胞膜片工程的未來發展取決于是否能夠獲得精確優化的PNIPAM接枝表面，從而用以控制異型細胞膜片的制造。一種有前景的方法依賴于使用厚度和接枝密度可控的PNIPAM刷（通過受控游離基聚合來制備，例如原子轉移自由基聚合（ATRP）和可逆加成-斷裂鏈轉移（RAFT）聚合）。19-21 這些新型智能表面的開發及其研究以及其醫療用途將開辟生物和醫學領域的新領域。 ?

 

參考文獻

1.Vacanti CA. 2001. The Impact of Biomaterials Research on Tissue Engineering. MRS Bull.. 26(10):798-799. http://dx.doi.org/10.1557/mrs2001.207

2.Yamada N, Okano T, Sakai H, Karikusa F, Sawasaki Y, Sakurai Y. 1990. Makromol. Chem., Rapid Commun.. 11(11):571-576. http://dx.doi.org/10.1002/marc.1990.030111109

3.Schild H. 1992. Poly(N-isopropylacrylamide): experiment, theory and application. Progress in Polymer Science. 17(2):163-249. http://dx.doi.org/10.1016/0079-6700(92)90023-r

4.Heskins M, Guillet JE. 1968. Solution Properties of Poly(N-isopropylacrylamide). Journal of Macromolecular Science: Part A - Chemistry. 2(8):1441-1455. http://dx.doi.org/10.1080/10601326808051910

5.Ding Z, Chen G, Hoffman AS. 1996. Synthesis and Purification of Thermally Sensitive Oligomer?Enzyme Conjugates of Poly(N-isopropylacrylamide)?Trypsin. Bioconjugate Chem.. 7(1):121-125. http://dx.doi.org/10.1021/bc950087r

6.Stuart MAC, Huck WTS, Genzer J, Müller M, Ober C, Stamm M, Sukhorukov GB, Szleifer I, Tsukruk VV, Urban M, et al. 2010. Emerging applications of stimuli-responsive polymer materials. Nature Mater. 9(2):101-113. http://dx.doi.org/10.1038/nmat2614

7.Okada Y, Tanaka F. 2005. Cooperative Hydration, Chain Collapse, and Flat LCST Behavior in Aqueous Poly(N-isopropylacrylamide) Solutions. Macromolecules. 38(10):4465-4471. http://dx.doi.org/10.1021/ma0502497

8.Kujawa P, Aseyev V, Tenhu H, Winnik FM. 2006. Temperature-Sensitive Properties of Poly(N-isopropylacrylamide) Mesoglobules Formed in Dilute Aqueous Solutions Heated above Their Demixing Point. Macromolecules. 39(22):7686-7693. http://dx.doi.org/10.1021/ma061604b

9.Xia Y, Burke NAD, St?ver HDH. 2006. End Group Effect on the Thermal Response of Narrow-Disperse Poly(N-isopropylacrylamide) Prepared by Atom Transfer Radical Polymerization. Macromolecules. 39(6):2275-2283. http://dx.doi.org/10.1021/ma0519617

10.Duan Q, Miura Y, Narumi A, Shen X, Sato S, Satoh T, Kakuchi T. 2006. Synthesis and thermoresponsive property of end-functionalized poly(N-isopropylacrylamide) with pyrenyl group. J. Polym. Sci. A Polym. Chem.. 44(3):1117-1124. http://dx.doi.org/10.1002/pola.21208

11.Kujawa P, Segui F, Shaban S, Diab C, Okada Y, Tanaka F, Winnik FM. 2006. Impact of End-Group Association and Main-Chain Hydration on the Thermosensitive Properties of Hydrophobically Modified Telechelic Poly(N-isopropylacrylamides) in Water. Macromolecules. 39(1):341-348. http://dx.doi.org/10.1021/ma051876z

12.Kujawa P, Tanaka F, Winnik FM. 2006. Temperature-Dependent Properties of Telechelic Hydrophobically Modified Poly(N-isopropylacrylamides) in Water:  Evidence from Light Scattering and Fluorescence Spectroscopy for the Formation of Stable Mesoglobules at Elevated Temperatures. Macromolecules. 39(8):3048-3055. http://dx.doi.org/10.1021/ma0600254

13.Tanaka F, Koga T, Kojima H, Winnik FM. 2009. Temperature- and Tension-Induced Coil?Globule Transition of Poly(N-isopropylacrylamide) Chains in Water and Mixed Solvent of Water/Methanol. Macromolecules. 42(4):1321-1330. http://dx.doi.org/10.1021/ma801982e

14.Zhang Y, Furyk S, Bergbreiter DE, Cremer PS. 2005. Specific Ion Effects on the Water Solubility of Macromolecules:  PNIPAM and the Hofmeister Series. J. Am. Chem. Soc.. 127(41):14505-14510. http://dx.doi.org/10.1021/ja0546424

15.Akiyama Y, Kikuchi A, Yamato M, Okano T. 2004. Ultrathin Poly(N-isopropylacrylamide) Grafted Layer on Polystyrene Surfaces for Cell Adhesion/Detachment Control. Langmuir. 20(13):5506-5511. http://dx.doi.org/10.1021/la036139f

16.Yang J, Yamato M, Nishida K, Ohki T, Kanzaki M, Sekine H, Shimizu T, Okano T. 2006. Cell delivery in regenerative medicine: The cell sheet engineering approach. Journal of Controlled Release. 116(2):193-203. http://dx.doi.org/10.1016/j.jconrel.2006.06.022

17.Tsuda Y, Kikuchi A, Yamato M, Chen G, Okano T. 2006. Heterotypic cell interactions on a dually patterned surface. Biochemical and Biophysical Research Communications. 348(3):937-944. http://dx.doi.org/10.1016/j.bbrc.2006.07.138

18.Ebara M, Yamato M, Aoyagi T, Kikuchi A, Sakai K, Okano T. 2004. Temperature-Responsive Cell Culture Surfaces Enable ?On?Off? Affinity Control between Cell Integrins and RGDS Ligands. Biomacromolecules. 5(2):505-510. http://dx.doi.org/10.1021/bm0343601

19.Mizutani A, Kikuchi A, Yamato M, Kanazawa H, Okano T. 2008. Preparation of thermoresponsive polymer brush surfaces and their interaction with cells. Biomaterials. 29(13):2073-2081. http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2008.01.004

20.Takahashi H, Nakayama M, Yamato M. Biomacromolecules, ASAP.

21.For a brief introduction to ATRP and RAFT polymerizations, please see Material Matters? 2010, Vol.5, No.1.. Available from:https://www.sigmaaldrich.com/US/en/collections/material-matters