免疫印跡膜剝離和重新檢測
疫印跡是研究蛋白質(zhì)功能和定位的常用技術(shù)。通常，蛋白質(zhì)樣品可在SDS-PAGE上分離并轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(NC膜)或PVDF膜上，然后用特異性抗體進行檢測。與可重復利用Southern和Northern印跡的核酸技術(shù)不同，免疫印跡很難重復使用。
免疫印跡的剝離和重新檢測技術(shù)具有以下幾個優(yōu)點：
1.有利于昂貴或量少或珍稀樣本的多次雜交；
2.有利于用不同抗體分析單次印跡上的不同蛋白，比如不同亞型的抗體；
3.有利于對異常結(jié)果進行重分析或確認；
4.有利于糾正孵錯的抗體；
5節(jié)約試劑成本，并節(jié)約時間。
目前已經(jīng)公布了幾種用于從免疫印跡上剝離抗體的方案，包括低pH、加熱和去垢劑以及離液劑等方法。以下是三種推薦方案。第一種方案適用于任何化學發(fā)光底物系統(tǒng)，即通過加熱和去垢劑的組合來解離抗體。第二種常用于抗體必須與抗原分離的應用，即采用低pH值來改變抗體的結(jié)構(gòu)，使結(jié)合位點失活。
第三種方案利用具有特殊配方的Western Blot Stripping Buffer（蛋白質(zhì)印跡剝離緩沖液）從免疫印跡膜上剝離抗體。該方法的優(yōu)勢在于：
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避免吸入與β-巰基乙醇有關(guān)的刺激性氣味。
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可在室溫條件下處理。
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可在15分鐘內(nèi)剝離抗體。
這些方法都不能去除顯色檢測系統(tǒng)所產(chǎn)生的有色沉淀（如BCIP、4CN、DAB和TMB）。但是，仍可以利用靶向不同目標蛋白的另一種抗體來分析印跡。
通常，這些方案僅能用于定性用途，除非已經(jīng)確定剝離過程不會影響指定抗原的定量結(jié)果。許多抗原將經(jīng)歷至少5次剝離循環(huán)，具體取決于所用的方法和膜類型。但是，應該考慮到在每個剝離循環(huán)中，都將洗去少量的膜固定蛋白。如果需要連續(xù)檢測幾種抗原，建議從預期豐度較低或產(chǎn)生信號較少的抗原開始。
在設(shè)計具有一輪或多輪抗體剝離的免疫印跡實驗時，可參考以下建議。
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PVDF膜比硝酸纖維素膜更堅韌，因此推薦用于任何涉及抗體剝離的方案。
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從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)印完成后立即干燥PVDF膜，可改善蛋白質(zhì)與膜的結(jié)合，特別推薦用于涉及多次剝離的實驗。在第一輪免疫檢測之前，必須使用乙醇將干燥的PVDF膜潤濕。
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優(yōu)先檢測低豐度抗原。
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先使用親和力低的抗體，再使用高親和力抗體。
重要提示：盡管建議在轉(zhuǎn)印后立即干燥PVDF印跡，但不可在兩輪免疫檢測之間干燥印跡，否則，任何殘留的抗體分子將與膜永久結(jié)合。
方案1：通過加熱和去污劑剝離
所需設(shè)備和溶液
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標準印跡或印跡條，在硝酸纖維素或PVDF膜上。
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封閉液。
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剝離溶液：100 mM 2-巰基乙醇 (M301574)、2% (w/v) SDS (S108346)、62.5 mM Tris-HCl (T105291), pH 6.7。
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磷酸鹽緩沖鹽（PBS）：10 mM 磷酸鈉、pH 7.2，0.9%（w/v）NaCl。
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淺托盤，能容納膜
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陽性和陰性剝離對照。
操作流程
1.在通風櫥內(nèi)，將印跡放入剝離溶液中，50 °C搖動孵育30分鐘。
2.將印跡放入緩沖液中，搖動10分鐘。使用新鮮的緩沖液重復一次。
3.可選: 重復初始檢測操作（省略一抗步驟），
4.以確?？贵w已失活或從膜上剝離。
5.將印跡放入緩沖液中，搖動10分鐘。
6.繼續(xù)進行封閉步驟，進行下一輪的免疫檢測。
方案2：通過低PH值剝離
所需設(shè)備和溶液
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標準印跡或印跡條，在硝酸纖維素或PVDF膜上。
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封閉液。
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磷酸鹽緩沖鹽（PBS）：10 mM 磷酸鈉、pH 7.2，0.9%（w/v）NaCl。
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淺托盤，能容納膜
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陽性和陰性剝離對照。
操作流程
1.將印跡放入剝離溶液中，搖動孵育30分鐘。
2.將印跡放入緩沖液中，搖動10分鐘。使用新鮮的緩沖液重復一次。
3.繼續(xù)進行封閉步驟，進行下一輪的免疫檢測。
方案3：利用WESTERN BLOT STRIPPING BUFFER（蛋白質(zhì)印跡剝離緩沖液）
抗體剝離液對硝酸纖維素和PVDF膜均具有良好的剝離效果。但在待剝離膜具有較高信號或抗體剝離液體處理不充分時效果更好。
所需設(shè)備和溶液
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標準印跡或印跡條，在硝酸纖維素或PVDF膜上。
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封閉液。
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保鮮膜，用于保存不會立即再次檢測的印跡。
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Western Blot Stripping Buffer（蛋白質(zhì)印跡剝離緩沖液）
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蒸餾水，用于稀釋試劑。
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淺托盤，能容納膜
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陽性和陰性剝離對照。
操作流程
注意：若要重復使用印跡或單個印跡條，應在第一次使用后立即剝離。如果不能立即剝離，應將膜包在保鮮膜中并置于PBS中，保存在4°C。切勿將印跡干燥保存。
1.在塑料托盤中加入適量的1X Antibody Stripping Solution（緩沖液套餐中提供）
2.用鑷子將印跡或印跡條浸入剝離液中。在室溫下，輕輕混合孵育15分鐘。在一個干凈的塑料托盤中裝入相同量的封閉液。
3.可使用傳統(tǒng)的封閉液，如20 mM Tris HCL、pH 8.0，150 mM NaCl，0.1% 吐溫20，5%奶粉，或者類似溶液。
4.使用封閉液清洗印跡2次，每次5分鐘。
5.現(xiàn)在，可使用抗體再次檢測印跡。
