維甲酸與基因表達(dá)

 

全反式維甲酸(RA, ATRA)是一種多效激活因子，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)與正常脊椎動物細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、凋亡和胚胎發(fā)育等過程相關(guān)的基因。維甲酸及其作為激活配體的受體蛋白是眾多分析維甲酸介導(dǎo)基因表達(dá)的研究熱點(diǎn)。目前的技術(shù)，包括siRNA敲除特定基因，RT-PCR評估基因表達(dá)，染色質(zhì)免疫沉淀，已經(jīng)成為擴(kuò)展經(jīng)典RA信號通路認(rèn)知的關(guān)鍵。 
 

維生素A (全-反式-維甲酸)及其酯是功能性RA的前體，而胡蘿卜素，特別是β-胡蘿卜素，是由植物合成的維生素A前體（詳見圖 1、2、3）。類維生素A這一術(shù)語既包括結(jié)構(gòu)上與維生素A有關(guān)的化合物，也包括具有生物維生素A活性的化合物。動物通過代謝飲食中的胡蘿卜素生成脂溶性類維生素A，并將類維生素A主要儲存在肝臟中；動物不能通過其他機(jī)制合成類維生素A。胡蘿卜素存在于幾種食用植物中，包括黃色、紅色或深綠色的蔬菜，以及紅色或黃色的非柑橘類水果。人類主要的動物性維生素A飲食來源包括肝臟、魚類和魚油，如金槍魚、沙丁魚和鱈魚的魚油。在美國，乳制品通常補(bǔ)充維生素A和維生素D。維生素A攝入后與視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)結(jié)合，用于血漿運(yùn)輸和細(xì)胞攝取。β-胡蘿卜素和維生素A酯成為乳糜微粒殘留物的伴侶后，經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)被細(xì)胞表面受體吸收。1

 

 

細(xì)胞內(nèi)維生素A水平由細(xì)胞視黃醇結(jié)合蛋白(CRBPs)和細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白(CRABP-I和CRABP-II)維持。2CRBP與視黃酸酯的儲存和運(yùn)輸有關(guān)，而CRABP則是視黃酸的伴侶?；钚灶惥S生素A的內(nèi)源性濃度是至關(guān)重要的，并處于嚴(yán)密的體內(nèi)平衡控制下，因?yàn)轭惥S生素A水平過高或缺乏均可致畸。2 

 

β-胡蘿卜素通過酶促氧化裂解β-胡蘿卜素15,15 '-單氧化酶(EC 1.14.99.36)，從而形成視黃醛的兩個(gè)分子。3,4 β-胡蘿卜素15,15 '-單氧化酶的基因已經(jīng)確認(rèn)與各種各樣的物種有相當(dāng)數(shù)量的同源性，包括人類、小鼠、雞、斑馬魚、果蠅、和藍(lán)藻魚腥藻和聚球藻種。

 

維生素A及其酯通過兩步氧化過程轉(zhuǎn)化為維甲酸及相關(guān)化合物。視黃醇在視黃醇脫氫酶(EC 1.1.1.105)或其他醇脫氫酶的作用下被氧化成視黃醛。視黃醛隨后被視黃醛脫氫酶(EC.1.2.1.36)氧化成RA。2 細(xì)胞維甲酸結(jié)合蛋白I (CRBP-I)作為維甲酸和視黃醛的伴侶，通過氧化酶促進(jìn)其代謝。

 

類維生素A核受體蛋白

視黃酸受體(RAR)和視黃酸X受體(RXR)是參與視黃酸介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的兩個(gè)核受體蛋白家族。5 這些受體蛋白是類固醇/甲狀腺/維甲酸核受體核轉(zhuǎn)錄家族的成員。這些核受體結(jié)合在一起，能夠轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)數(shù)百個(gè)基因。RAR和RXR各有三個(gè)同位型，分別為α、β和γ。盡管每個(gè)RAR同位型的基因序列與另外兩個(gè)同位型有很大的差異，但每個(gè)同位型的基因序列在人和小鼠之間高度保守，因此推測每個(gè)RAR同位型具有其特定的功能。6除了這三種同位型外，RAR和RXR都被發(fā)現(xiàn)作為多種同位型存在，這些同位型是由一個(gè)主要轉(zhuǎn)錄本的選擇性剪接或啟動子使用差異造成的。7

RAR和RXR受體蛋白的單體形式無活性。RAR自身不形成同源二聚體，而是與RXR形成異源二聚蛋白(RAR:RXR)。該RAR:RXR蛋白復(fù)合物是維甲酸信號的主要受體復(fù)合物。除了與RAR形成異源二聚體外，RXR還能與包括PPAR在內(nèi)的其他受體蛋白進(jìn)行二聚化。5 

 

RAR:RXR蛋白復(fù)合物與維甲酸反應(yīng)成分(RREs)或類維甲酸X反應(yīng)成分(RXREs)結(jié)合，每個(gè)反應(yīng)成分都是成分明確的DNA序列。7 RXR增強(qiáng)了RAR蛋白與RARE序列的結(jié)合。5在配體受體結(jié)合位點(diǎn)缺乏配體的情況下，apo-RAR:RXR異源二聚體會集合干擾轉(zhuǎn)錄過程的輔抑制物、蛋白質(zhì)和酶。8核受體輔抑制物(NCoR)和視黃酮和甲狀腺激素受體(SMRT)的沉默介質(zhì)通過結(jié)合RAR和RXR的配體結(jié)合域抑制轉(zhuǎn)錄。隨后結(jié)合含有組蛋白去乙酰化酶活性(HDACs)的蛋白復(fù)合物，這些酶在核小體內(nèi)對組蛋白去乙?；Ｒ阴；娜コ黾恿私M蛋白尾部的正電荷，從而增加了組蛋白對帶負(fù)電荷的染色質(zhì)的吸引力。結(jié)果是染色質(zhì)變得更加緊密，限制了轉(zhuǎn)錄因子附著在基因起始位點(diǎn)的能力，限制或阻止了轉(zhuǎn)錄 (見 圖4）。9 

 

 

RA和9-順-維甲酸 (9-反-RA)與RAR的配體受體結(jié)合位點(diǎn)有很強(qiáng)的親和力。9-順RA對RXR的配體結(jié)合位點(diǎn)有很強(qiáng)的親和力,但RA不是RXR的配體。盡管9-順RA在體外表現(xiàn)出對RXR的特異性，但是并沒有證據(jù)表明9-順RA是體內(nèi)RXR活化的實(shí)際配體。1

如果配體附著在RXR的配體結(jié)合區(qū)域，其構(gòu)象的改變不足以克服輔抑制物的集合。該無法激活RXR以啟動受體通路現(xiàn)象被稱為RXR從屬或apo-RAR沉默。5,10或者，當(dāng)RA或另一種類視黃素結(jié)合至RAR配基的配體結(jié)合區(qū)域時(shí)，蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化足以使募集到的輔抑制復(fù)合物轉(zhuǎn)化為輔活化物。如果RAR和RXR的結(jié)合域都有配體，則蛋白復(fù)合物的折疊性增強(qiáng)。RA通過CRABP-II從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，CRABP-II將RA作為伴侶蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至RAR:RXR異源二聚體的RAR域的配體受體結(jié)合位點(diǎn)。11 

 

維甲酸介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄經(jīng)典途徑

RA調(diào)控基因表達(dá)的經(jīng)典途徑有四個(gè)特定的步驟，盡管這些步驟的順序并不是對所有基因都相同。7,8 RA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄被定義為12：

• RA或其他類維生素A配體與配體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合

• 受體二聚化(RAR:RXR二聚化)

• 受體異源二聚體與DNA (RAREs)結(jié)合

• 通過染色質(zhì)重構(gòu)和轉(zhuǎn)錄機(jī)制的募集，對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控

DNA結(jié)合直接受修飾核小體染色質(zhì)結(jié)構(gòu)并使轉(zhuǎn)錄機(jī)制進(jìn)入基因啟動子區(qū)域的輔激活物和輔抑制物的作用影響。

 

一旦類維生素A的結(jié)合修飾了RAR:RXR復(fù)合物，輔抑制物即與復(fù)合物分離，并募集輔激活物。轉(zhuǎn)錄機(jī)制復(fù)合體必須進(jìn)行染色質(zhì)重構(gòu)后才能獲得待轉(zhuǎn)錄的基因。類固醇受體輔激活物(SRC)蛋白和具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)活性的p160蛋白可以在配體存在的情況下附著于RAR或RXR的配體結(jié)合域。SRC輔激活物則乙?；疍NA結(jié)合位點(diǎn)附近的核心組蛋白中的賴氨酸殘基，中和組蛋白電荷并減弱與染色質(zhì)的相互作用。染色質(zhì)變得松散，變得更容易參加DNA轉(zhuǎn)錄機(jī)。9 

 

ATP依賴的染色質(zhì)重構(gòu)蛋白（如SWI/SNF）利用ATP水解的能量重新定位核小體結(jié)合到基因啟動子區(qū)域，形成無核小體或核小體間隔區(qū)域，為轉(zhuǎn)錄機(jī)提供通路。額外的輔激活或輔整合蛋白的一個(gè)例子是p300/CRB蛋白。p300/CRB通過募集額外的通用轉(zhuǎn)錄因子至啟動子區(qū)域，并與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄機(jī)結(jié)合，在類維甲酸通路中發(fā)揮作用。(見 圖5)。7,8

 

 

染色質(zhì)重構(gòu)后，輔活化子游離出來，可能會被蛋白酶體降解。包含復(fù)合物(SMCC)的SRB和中介隨后被類維生素A受體所吸收。介質(zhì)復(fù)合物促進(jìn)轉(zhuǎn)錄機(jī)制，包括RNA聚合酶II (Pol II)、基因轉(zhuǎn)錄中的關(guān)鍵酶，進(jìn)入基因啟動子的起始位點(diǎn)。染色質(zhì)重構(gòu)也促進(jìn)了其他轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。RA啟動了TNF-α-誘導(dǎo)的與NF-κB的結(jié)合，并與TNF-α協(xié)同作用去招募并刺激與酶活性相關(guān)的Pol II的磷酸化，(見 圖6)。13 

 

基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控

RA影響的生理過程的多樣性可能部分歸因于RAR和RXR受體家族中可能存在的組合和冗余。盡管RARs是啟動類視網(wǎng)膜通路的主要因素，而RXRs除了介導(dǎo)RARE被RARs附著外，還可能對這一過程起協(xié)同作用。5 在一項(xiàng)定性研究中，Balmer和Blomhoff回顧了發(fā)表的532個(gè)由RA調(diào)控的基因的數(shù)據(jù)。他們對文獻(xiàn)的分析包括評估哪些基因強(qiáng)有力的證據(jù)證明其被經(jīng)典通路所調(diào)控。12只有27個(gè)基因被強(qiáng)烈認(rèn)為受經(jīng)典通路調(diào)控，其中26個(gè)基因上調(diào)，一個(gè)基因被可變調(diào)控。不考慮通路，RA上調(diào)的基因數(shù)量為311個(gè)；有趣的是，212個(gè)基因要么下調(diào)，要么被可變調(diào)控。直接的、經(jīng)典的途徑雖然提供了RA功能一些視角，但并不是RA受影響表達(dá)的唯一的方法。

 

RA通路的綜述通常包括泛素化和磷酸化作為下游過程，對基因調(diào)控和轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要。1,7,8泛素化終止類維生素A的信號通路后，RAR/RXR被蛋白酶體降解，因此泛素化可能通過啟動終止過程介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。磷酸化是非常重要的，因?yàn)镽AR和RXR亞型可以作為激酶底物發(fā)揮作用。磷酸化可能參與蛋白體降解，影響全RAR:RXR復(fù)合物與共調(diào)節(jié)因子和通用轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力。8 磷酸化的絲氨酸殘基RARγ已經(jīng)被證明能夠控制RARγ的反式激活和由蛋白酶體對RARγ的降解。7

 

介質(zhì)蛋白的表達(dá)可能為間接調(diào)控轉(zhuǎn)錄提供了一種解釋機(jī)制。RA可能通過調(diào)控其他轉(zhuǎn)錄因子而不依賴與RAREs的結(jié)合來調(diào)控基因表達(dá)。1 這種間接調(diào)控可以解釋干擾蛋白的調(diào)控和表達(dá)導(dǎo)致的目標(biāo)基因下調(diào)。

 

RIP140是一種輔助抑制蛋白，優(yōu)先與配體附著的RAR結(jié)合，而不是與通常招募輔助抑制蛋白的apo-RAR:RXR復(fù)合物結(jié)合。RIP140抑制多個(gè)配體結(jié)合核受體的反式激活功能，并將HDACs招募到RAR:RXR結(jié)合的基因啟動子。RIP140可將HDAC招募到其他蛋白中作為底物使用，或者也可自身作為HDAC的底物發(fā)揮作用。RIP140這種輔抑制物的選擇性結(jié)合被推測為類維生素A信號通路提供一種調(diào)節(jié)基質(zhì)。10,14 最近使用經(jīng)RIP140 siRNA處理的NT2/D1細(xì)胞開展的研究發(fā)現(xiàn)，依賴于RA的基因表達(dá)水平出現(xiàn)了顯著的變化，而不是不依賴于RA的基因。15 

 

除了RAR和RXR受體家族外，RA還作為過氧化物酶體增殖物激活受體PPARβ/δ的配體，以及誘導(dǎo)細(xì)胞生存基因的核受體。11 脂肪酸結(jié)合蛋白5(FABP5)作為轉(zhuǎn)移RA至PPARβ/δ受體的一個(gè)伴侶蛋白。RA在核內(nèi)RAR和PPARβ/δ的分配分別由轉(zhuǎn)移蛋白CRABP-II和FABP5調(diào)控，并且FABP5表達(dá)增加會使RA向PPARβ/δ的轉(zhuǎn)移增加。21,23 相對于CRABP-II伴侶蛋白的表達(dá)濃度，表達(dá)高濃度脂肪酸結(jié)合蛋白5 (FABP5)伴侶蛋白的MCF-7細(xì)胞，與細(xì)胞存活和增殖相關(guān)。11 除了核基因轉(zhuǎn)錄外，RA還被證明可以介導(dǎo)線粒體基因的轉(zhuǎn)錄；雖然這一機(jī)制還未明確，但已經(jīng)確立了包括直接和間接的表達(dá)途徑的理論。16 

 

由于RXR能夠與包括其他PPAR在內(nèi)的其他核受體形成異源二聚體，因此它可以與PPAR介導(dǎo)的其他信號通路發(fā)生交聯(lián)。7,8 9-順RA可以作為PPAR:RXR的單一激活配體，9-順RA和其他維甲酸(RXR的特異性配體化合物)可以通過激活PPAR:RXR二聚體，不依賴于PPAR配體而啟動PPAR信號通路。7,8 此外，非維生素A原類胡蘿卜素可能會與PPAR受體相互作用，因?yàn)镻PAR可以被各種親脂分子激活。17 維甲酸已表現(xiàn)出靶向P13K/Akt通路，早期Akt活性增加，但后期Akt活性降低。18 維甲酸影響的其他替代機(jī)制可能仍有待發(fā)現(xiàn)。

 

由于有大量基因受RA信號影響，因此內(nèi)源性維甲酸水平對正常發(fā)育至關(guān)重要。極端濃度水平對分化細(xì)胞是致畸的，規(guī)定的濃度范圍是正常胚胎發(fā)育所必需的。合成的類維生素A、類維生素A和維甲酸的代謝阻斷劑(RAMBAs)目前正在研究其作為RAR/RXR配體修飾信號，通過細(xì)胞色素P450酶(CYPs)阻斷RA代謝，以及提高內(nèi)源性RA水平這幾方面的潛在價(jià)值。19,20

 

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